饶毅：中国在重大传染病方面最佳基础科学发现
作者：饶毅
来源：饶议科学
时间：2022-08-23
李文辉的工作也是从1980年代中期到2022年近四十年来乙型肝炎基础研究的最重要工作。
导读
对于危害人类的传染病，全世界前赴后继有很多研究工作。近代科学让科学家可以对传染病的基本原理、发病过程的分子机理、免疫等进行诸多方面的基础研究。二十世纪我国对传染病最重要的研究是北京生物制品研究所汤飞凡（1897-1958）先生发现沙眼致病的病原体和二十一世纪初袁国勇等确定SARS病毒是传染病最重要的两项临床研究。迄今对传染病的基础研究最重要的工作是北京生命科学研究所李文辉发现乙型肝炎病毒（HBV）受体，从而帮助人类理解HBV进入人类细胞的原理、有助于进一步设计治疗方法。乙型肝炎研究迄今三大进展：1970年代发现乙型肝炎病毒，1980年代初发明乙肝疫苗，2012年发现乙肝病毒和丁肝病毒受体。前两个是国外科学家的工作，第三个是北京生命科学研究所的李文辉及其实验室。李文辉的工作也是从1980年代中期到2022年近四十年来乙型肝炎基础研究的最重要工作。目前，并不清楚李文辉实验室发现的受体是唯一受体，抑或还有其他受体，但李文辉等发现的NTCP应该是受体之一或受体的组分之一。没有迹象NTCP与受体无关。在李文辉之前二十多年很多人试图寻找HBV受体但铩羽而归，即使在他们2012年发现NTCP为受体后十年，全世界仍然没有找到另外的受体，说明发现HBV受体之艰难。所以，发现NTCP是公认的突破。即使以后再发现受体，也是晚了十年以上。当然，如果再发现的受体是直接结合乙肝病毒的关键，而NTCP只是辅助，那么存在着以后发现的受体本身对于乙肝病毒感染的重要性超过现在知道的NTCP的可能性。这只是可能性，是尚未证实的可能性。今天，肝炎研究领域的科学家，包括两位因为丙型肝炎（HCV）研究而获诺奖的科学家，一致公认李文辉工作的重要性。（说明：按未来科学奖的规定，作为科学委员会成员的我不能提名，所以这些文字没有成为任何提名的材料。按照未来科学奖规定，生命科学委员会年度主席不能主持对候选人的文字介绍，所以生命科学组的成员在评审和讨论过程中也没有看过这些文字。在连续几年讨论后，2022年李文辉获得未来科学奖生命科学奖。在科学委员会全体委员投票后，在生命科学组确定了发布的文字之后，我与生命科学组共享了这篇文章。）2012年11月13日，新的生物学刊物eLife发表论文：中国科学家攻克了一个长期困扰国际科学界的难题，而这一基础科学问题也与人类、特别是中国人民的健康相关。过去，世界和中国忽略了1980年代我国科学家在条件艰苦时代做出重要贡献，我们赞叹中国医学科学院的余昌晏和庞其方等、广西肿瘤防治研究所的严瑞琪和苏建家建立乙肝动物模型；现在，我国已经有条件和能力改革科学管理体制机制、提供适当环境，让一些科研机构年富力强的科学家心无旁骛，如北京生命科学研究所的李文辉带领学生和同事发现乙肝病毒受体；将来，希望全国科研机构能推广适合各个学科和机构自身规律的体制机制改革，使大批年轻人集中精力在专业上充分发挥作用，他们大有作为才能使中国的科学大有希望。肝炎在全世界有广泛的危害，中国人群肝炎患病率尤其高。多种病毒导致病毒性肝炎：甲、乙、丙、丁、戊（A、B、C、D、E）等。全球二十亿人曾感染乙型肝炎病毒（HBV），慢性乙肝感染超过2.5亿人。即使在乙肝疫苗已经研制成功多年以后，我国还有逾九千万人感染过乙肝病毒，上千万乙肝患者，每年感染超过百万。肝炎不仅本身给患者带来折磨，慢性肝炎更是经常转变为肝癌、肝硬化。全球超过50%的肝癌继发于肝炎，超过50%的肝硬化继发于肝炎，每年约七十万人死于病毒性肝炎及其继发疾病。在人类研究乙型肝炎的历程上，英国医生MacCallum(1946)首先认识到乙肝不同于甲型肝炎，前者通过血液和体液传染，后者通过食物和水传染，它们的病原都小于细菌。1967年，Saul Krugman等可以明确区分甲型和乙型肝炎。1960年代，美国科学家Baruch Blumberg在研究血友病和白血病的过程中（Blumberg, 1964），发现“澳大利亚抗原”（澳抗）(Blumberg et al., 1965)。起初知道与多次输血有关，到1967年发现一例唐氏综合症（先天愚型）患者开始没有澳抗，后来产生澳抗，而且患了肝炎（Blumberg et al., 1967），并在血液中出现病毒样颗粒（Bayer et al., 1968），从而意识到澳抗可能与乙肝更相关。纽约血液中心病毒研究室的Alfred Prince与韩国合作者从输血导致的肝炎病人中寻找抗原（Prince et al., 1964; Chung et al., 1964），发现了他称为SH（血清肝炎）的抗原与病毒性肝炎相关(Prince, 1968)。日本东京大学医院输血科的Okochi和Murakami于1968年发现输血病人中病毒性肝炎与澳抗有一定、但非绝对相关性。Prince于1968年在《柳叶刀》报道澳抗与SH抗原相同。其后几年，Blumberg与Prince各自开展一系列工作获得更多证据表明他们发现的抗原与乙肝相关（Blumberg, 1971；Prince，1971）。1970年，英国的Dane等在澳抗阳性的肝炎患者血液中分离获得病毒颗粒，并用电子显微镜观察，确定澳抗是乙肝病毒颗粒的表面蛋白质（乙肝表面抗原，HBsAg）。1979年，法国的Galibert等克隆了乙肝病毒的基因组DNA；它很短，不过约三千二百碱基对。整个病毒的DNA短于人体很多单个基因的长度，却能肆虐人类，令人惊讶。丁型肝炎（HDV）的发现起始于1977年意大利的胃肠科医生Mario Rizzetto在HBV感染病人肝细胞中发现的一个新抗原(Delta抗原，HDAg)（Rizzetto et al., 1977）。其后，他们与美国分子病毒学家John Gerin等证明HDAg来源于一种新型肝炎病毒--HDV（Rizzetto et al., 1980；Rizzetto, Purcell and Gerin, 1980；Rizzetto et al., 1981）。HDV的全基因组于1986年被克隆（Wang et al., 1986）。HBV和HDV两病毒同时感染时，病情严重很多，且更容易导致慢性肝炎。HDV依赖于HBV提供的包膜蛋白（包括HBsAg在内三种）组成病毒颗粒，HDV复制的其它步骤独立于HBV。HBV是DNA病毒，HDV是RNA病毒，它们的基因组不同。研究乙肝病毒直接导致生产预防乙肝感染的疫苗，是基础研究很快走向为人民服务的一个成功范例。1971年Krugman开始研制乙肝疫苗。1978年有两个成功的疫苗（Purcell and Gerin, 1978; Hilleman et al., 1978），1980年通过临床验证（Szmuness et al., 1980）。这些疫苗都用来自于病人血浆提取的HBsAg，如果灭活不彻底，反而可以引起疾病。1979年，旧金山加州大学（UCSF）的William Rutter实验室用现代分子克隆方法，获得HBsAg的基因（Valenzuela et al., 1979）；1981年他们将人的HBsAg转到大肠杆菌中表达蛋白质（Edman et al., 1981）；1982年他们成功地将HBsAg转基因到酵母细胞表达，并获得病毒样颗粒（Valenzuela et al., 1982）。他们申请专利并与Merck公司合作，于1984年成功地用酵母表达的HBsAg作为疫苗，获得保护性的免疫作用，在猩猩中证明疫苗可以预防乙肝病毒侵染（McAleer et al., 1984）。他们的疫苗于1986年获得美国食物药品管理局（FDA）批准后上市。从此，这一基因工程制造的疫苗为世界上很多人提供了预防的方法。在乙肝曾经肆虐的我国台湾，使用乙肝疫苗后，乙肝和肝癌发病率直线下降。原华盛顿大学教授、当时Merck公司的总裁Roy Vagelos决定将一条生产线送给中国并培训中国技术人员使用生产线，中国得益于赠送的生产线制造乙肝疫苗，造福中国民众。全面接种乙肝疫苗可以使乙肝大幅度下降。不过，由于我国乙肝感染基数庞大等多种原因，还不断出现相当多的新的乙肝感染。而经济和社会发展不如我们的国家，乙肝继续蔓延。对已经感染乙肝的病人，疫苗不能治病。目前已有的乙肝治疗方法，其效果都比较有限。而丁型肝炎完全没有特异的治疗药物。乙肝和丁肝研究领域多年来翘首以盼获得病毒受体，以便研发新的抗肝炎病毒药物，包括设计和筛选针对受体的药物。研究乙型肝炎的最大困难之一是缺乏好用的体内感染的动物模型和体外用的培养细胞模型。这两大问题分别由中国科学家和法国科学家在1981至1984年和2002年取得突破。不过，法国的工作很多人马上知道，而中国的工作知道的时间较晚、知道的人较少。人类乙肝病毒能感染的动物很少：人和猩猩。它不感染老鼠或鸡等常用的一般实验动物，即使猴也不能感染人的乙肝病毒。土拨鼠、地松鼠、树松鼠、苍鹭和鸭等可以感染其本身的肝炎病毒而患病，但不能感染人的乙肝病毒。土拨鼠、地松鼠、树松鼠的肝炎病毒与人乙肝病毒有70%的相似性，而鸭和苍鹭与人乙肝病毒的相似性低很多。因为这些动物都不能感染人的乙肝病毒，所以其肝细胞的病毒受体可能与人肝细胞上结合人乙肝病毒的受体有所不同，不能作为研究人类乙肝病毒的良好模型。缺乏好的动物模型给研究人类乙型肝炎和寻找人类肝细胞上的乙肝病毒受体造成了一大难关。1982年，北京第二传染病院（现首都医科大学附属佑安医院）资料汇编中，中国医学科学院余昌晏等在1981年的会议上报道树鼩(tree shrew，Tupaia)可以被人的HBV感染，但在六周以后就出现动物死亡而未持续观察。1981年，《医学研究杂志》刊登中国医学科学院庞其方、万新邦、胥爱源、王祖铭、王桂香、朱宝友、张新生的文章“乙型肝炎病毒（HBV）感染树鼩的实验研究”。 医科院当年用树鼩试过多种病毒感染，比如他们曾于1981年9月在《中国医学科学院》发表文章“甲型肝炎病毒感染树鼩的初步研究”，发现树鼩可以感染人的甲型肝炎。甲肝论文的作者是医科院的詹美云、刘崇柏、李成明、张文英、朱纯、庞其方、赵同兴、王长安、王金利，和北京第二传染病院的余昌晏、李寿复、佟智功、林尊慧、牛京勤。1982年开始，广西的严瑞琪和苏建家及他们的合作者改进实验方法和条件，特别是动物饲养条件改善导致树鼩存活延长。1984年，《广西医学院学报》发表肿瘤研究室严瑞琪、苏建家、陈志英、刘由庚、甘友全、周德南的文章报道人血来源的HBV感染十只树鼩后，用血清免疫检测和肝脏组织切片，确定七只被感染、仅一只肯定没感染。1986年，《上海实验动物科学》杂志发表广西肿瘤防治研究所苏建家、严瑞琪、甘友全、周德南、黄定瑞、黄国华的论文，他们用了62只树鼩，其中53只接种人HBV，通过血清免疫学、肝组织切片确定总感染率为84%。他们还用了当时先进的分子杂交、电子显微镜等检测手段，其中电镜显示Dane颗粒，证明人HBV可以感染树鼩。1996年，瑞士苏黎世大学内科的Walter与德国Freiburg大学内科的Blum等开始用树鼩研究乙肝（Walter et al., 1996）。事实上在1996年以前，中国科学家已经多次重复和进一步研究人乙肝病毒感染树鼩，这其中既有广西的苏建家、严瑞琪课题组（苏建家等，1987；严瑞琪等，1989；黄定瑞等，1990；苏建家等，1992；苏建家等，1995；严瑞琪等，1996），也有其他中国科学家（刘芳华和饶娴宜，1987；李奇芬等，1995；王凤水等，1996）。1996年后还有很多工作（李瑗等，2011）。也就是说，1980到1990年代，中国科学家一系列工作找到了人和猩猩之外唯一能感染人乙肝病毒的、经济、易用的动物模型--树鼩。Walter的文章仅引用苏建家等（1987）和严瑞琪等（1989）论文，而不知道1996年以前的多篇中国论文，更不了解1981年到1986年的几篇中国摘要和论文。Walter等重复了中国科学家的研究，证实人乙肝病毒注射到树鼩可以导致急性乙型肝炎，表明树鼩可以作为人类乙肝病毒研究的体内模型。他们还发现，将树鼩肝脏的细胞分离后在体外培养（所谓“原代培养”），也可以感染人类乙肝病毒，从而证明树鼩可以作为人类乙肝病毒研究的体外细胞模型。不过，用原代培养的细胞需要经常从动物肝脏分离细胞，不方便。更稳定好用的是可以在体外传代培养的细胞系。2002年，法国国家医学研究所的Gripon等从人的肝脏分离细胞，并在化合物处理后纯化、筛选，最终获得一株细胞系HepaRG，用多种检测证明它可以感染人的乙肝病毒，从而提供了一个实用的体外培养细胞模型，不过具体用的时候较麻烦：需要用两步培养、诱导，花几周时间后才能进入可感染状态。病毒感染细胞一般首先要病毒结合于细胞膜表面的受体，然后进入细胞内。不同的病毒需要各自的受体，有相应受体的细胞才能有效地被病毒感染。在人群中，有些人天生命好（具体是遗传和变异带来的好处），其受体分子不能与某些病毒结合，所以天生不会患某种传染病。在科研中，有些病毒的受体很快被科学家找到，如SARS病毒的受体。但是，有些病毒的受体很难被发现。乙肝病毒本身用什么蛋白质与细胞表面的受体结合？已知在结合特异受体之前，该病毒可以与细胞表面的硫酸肝素样分子相互作用而滞留于细胞表面（Schulze et al., 2007；Leistner et al., 2007）。1986年，纽约血液中心的Neurath等确定病毒的Pre-S1结构域有一小段（氨基酸21到47）可能对于结合细胞受体很重要（Neurath et al., 1986）。但其他实验室的一系列工作表明重要的结合位点在氨基酸9至15左右（Schulze et al., 2010）。2003年，德国科学家证明对感染人类肝细胞重要的Pre-S1和Pre-S2结构域，也对感染原代培养的树鼩肝细胞重要（Glebe et al., 2003），从而表明人和树鼩的肝细胞含有的乙肝受体可能都结合乙肝病毒的同样蛋白质。这篇文章引用中国的树鼩感染HBV的文章是严瑞琪等（1996）。肝细胞表面是什么受体能结合乙肝病毒，从而导致病毒感染？自从1960年代发现乙肝病毒后迄今近五十年，还没有找到受体，不是因为没人找，而是很难找。北京生命科学研究所的研究员李文辉，是兰州大学本科生、北京协和医学院的博士、美国哈佛医学院的博士后。他在美国期间发现了SARS病毒的受体（Li et al., 2003）。回国加盟北生所后，他集中精力试图攻克乙肝病毒受体，几年来很少发表论文，坚持带领实验室的研究生、博士后和其他人员不懈努力，终于找到乙肝病毒和丁肝病毒共用的受体，于2012年11月13日在电子刊物eLife发表文章“钠离子-牛磺胆酸共转运多肽是乙型肝炎和丁型肝炎病毒的功能性受体”。文章的并列第一作者是北京大学生命科学学院与北生所联合培养的博士研究生严欢和北生所的博士后钟国才，其他还有徐广伟、何文辉、景致毅、郜振超、黄屹、祁永和、彭博、王海敏、付立冉、宋梅、陈盼、高文青、任碧杰、孙银燕、蔡涛、冯晓锋、隋建华。李文辉实验室的突破是在前人工作基础上迈进的一大步。他们用几个研究组均报道的乙肝病毒结合受体的肽段（Pre-S1的2至48氨基酸）（Barrera et al., 2005；Engelke et al., 2006；Glebe et al., 2005；Gripon et al., 2005），并将其修饰后作为探针，用中国科学家1980年代发现的树鼩为肝细胞来源得到原代培养的树鼩肝细胞（PTH）为材料，应用强有力的现代生物化学技术，寻找结合Pre-S1肽段的蛋白质，发现了钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）。用肽段竞争的方法，验证了NTCP结合Pre-S1的特异性。然后用分子生物学的RNA干扰技术，抑制PTH内源产生的NTCP，可以减少人乙肝和丁肝病毒的感染，从而证明NTCP对乙肝病毒和丁肝病毒感染是必需的。他们也发现如果使能感染HBV的HepaRG细胞中NTCP减少，就能降低这些细胞感染HBV。他们还发现，之所以HepaRG细胞需要用药物诱导两周后才能感染HBV的原因是诱导后细胞产生的NTCP增多。他们还用人的原代培养肝细胞，证明人的NTCP对乙肝病毒感染是必需的。为了知道NTCP是否对乙肝病毒感染是充分的，李文辉实验室用平常不能感染乙肝和丁肝病毒的Huh7和HepG2体外培养细胞系。他们通过转基因导入这些细胞后产生NTCP蛋白质，这些细胞就能被HBV或HDV所感染。此外，他们还确定了NTCP蛋白质结合病毒的关键氨基酸是157到165位。李文辉实验室取得突破的关键是用了质谱分析加双重亲和纯化。王晓东近年在北生所建立了几个质量非常好的平台，包括基因组和质谱平台。李文辉的第一项基本工作是在北生所高通量测序中心蔡涛的帮助下建立树鼩肝细胞的基因表达图谱，其后再用质谱分析树鼩肝细胞的蛋白质组。这是繁琐的、但基础性的工作，且需要高质量。他们的实验设计巧妙地标记了作为探针的Pre-S1肽段，将其受体结合位点的氨基酸改成可用光偶联的非天然氨基酸，这样光偶联的距离就为零。李文辉实验室还将肽段连接了单克隆抗体识别的位点和生物素标记。在光偶联以后，用单克隆抗体和结合生物素的分子通过亲和层析，可以抵抗强烈的洗脱以去除非特异结合的分子、留下特异结合的分子。这一方法值得学习。NTCP平时在肝脏起着基本作用：转运胆酸和钠离子。乙型肝炎和丁型肝炎病毒利用了这一正常蛋白质，与它结合而感染肝细胞。猴子的NTCP与人的NTCP很像，但在关键的157到165段不足够像，所以人乙肝病毒只能感染人的肝细胞、不能感染猴子的肝细胞。如果将这段人的序列放到猴NTCP序列中，改造后的猴NTCP也能介导人乙肝病毒感染。李文辉等用NTCP可以使常用的细胞（如HepG2）可以感染乙肝病毒，为乙肝研究领域提供了便宜且易用的细胞模型。以前发现的HepaRG细胞，购买和培养花费昂贵，而且需要两周诱导后才能感染。李文辉实验室的研究不但揭示了乙肝和丁肝病毒进入肝细胞的分子机理，而且在通往有效治疗乙肝的道路上迈出了重要一步。李文辉的工作没有结束：以NTCP发现为基础，寻找新的抑制HBV感染细胞的药物，给病人带来福音。李文辉文章发表的同一天，德国科学家致信祝贺李文辉在中国的工作“会改变HBV领域今后如何做研究、有助于开发很多病人需要的药物”。第二天，法国科学家也致信李文辉，祝贺他带来HBV领域的重大突破。1980年代，我国多方面条件比较差，科研人员的工作主要靠自身的坚持，少数能做出优秀成果。2010年代，我国已经具备基础和条件，而且已经有成功的范例，就不仅要依赖少数单位、少数科学家做出优秀成果，而希望大批科学工作者做出条件能支持的优秀工作，这就需要改革科学体制机制。众所周知，增长的科研经费如果用原封不动的旧方法管理和投入，其效果有限。而对于如何改革，不同行业、学科和时期有所不同。如何管理和使用我国日益增长的科研经费，使之发挥最佳效果？这不仅是科技人员关心，而且是国家非常关心、对人民有实际意义的重大问题。对世界，中国科学家最终要能产出对人类有益的知识，不再是单向消费或少产出知识；对中国，科学界既需要坚持科学探索带动我国的智识风尚，也需要有些（而不是全体）科学家做出有较快应用价值的成果。2004年，中组部、科技部、北京市为了改革科技体制作为试点成立的北生所，国家交给的任务是基础研究。成立8年来，北生所已获国际瞩目，2012年初美国HHMI（休斯医学研究所）评国际青年科学家（给予研究经费资助），中国获得7位，4位在北京生命科学研究所。北生所已有多项基础研究得到国际科学界瞩目。而李文辉团队的乙肝病毒研究的意义超出研究所平时的基础生物学研究范围，更容易为社会理解。北生所做出多项重要发现需要国家坚定支持，研究所发生危机幸亏国家鼎力相助。国家选拔王晓东为所长后充分信任他。王晓东对北生所的科学家高标准、严要求的同时充分支持。王晓东本人以基础科学研究闻名于世，但他一直注重可能的应用。他在北生所建立了梯队和平台，为基础和应用研究提供帮助；他坚持的政策使包括李文辉在内的北生所科学家可以追求自己最高科学目标；王晓东在李文辉几乎无产出的时候加建其研究需要的树鼩饲养设施，反映王晓东不仅慧眼识英才而且敢于承担责任；王晓东推动建立的技术平台，也为李文辉等实验室提供了优质的基础；北生所的行政和后勤，为研究人员提供保障和服务。这些为北生所取得多项重要研究成果奠定了基石。北生所的经验可以推广--政策、人员、模式，并无需增加国家科研拨款，而对已经计划的增加经费要求必须配套体制和机制改革。全国有很多地方，特别是北京以外的城市，也有适用北生所模式的机构和人员。也有不同机构和学科合适的其他模式需要得到合理实施。
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中国在重大传染病方面最佳基础科学发现
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